postheadericon Правила взятия проб и интерпретации серологических исследований

Правила взятия проб и интерпретации серологических исследований

В распознавании вирусных заболеваний, а в некоторых случаях также и бактериальных, можно применить много разных диагностических техник по обнаружению микробов, их белка или рибонуклеиновой кислоты (изоляция и идентификация, иммуногистохимические техники, опосредованная и непосредственная иммунофлюоресценция, PCR и т.д.), либо антител, направленных против их антигена (серонейт-рализация, опосредованная иммунофлюоресценция, иммунопероксидазовая реакция -IPMA, ELISA и т.д.)

Ввиду быстроты и низкой стоимости исследования и необходимого оборудования, а также возможности одновременного анализа большого числа проб в серологической диагностике повсеместно используется реакция ELISA. Серологические исследования дают возможность проводить только ретроспективный анализ проникновения микроба в стадо. Соответствующие антитела обнаруживаются только на 3-30 день после заражения, наибольшего уровня достигают на 30-80 день. При отсутствии реинфекции (повторного заболевания) гетерологическим штаммом их титры опускаются до уровня, который нельзя обнаружить спустя 4-12 месяцев. Так в момент обнаружения антител микроб уже высевается в среду или даже находится в ней как минимум несколько дней. Момент, когда начинается сероконверсия зависит прежде всего от вируса/бактерии, которым животное было инфицировано, возраста свиньи, состояния корма и наличия в среде иммуносупрессивных факторов.

Серологическое исследование

Серологическое исследование предоставляет точную информацию также при анализе распространения инфекции в стаде. Конечно же, ее можно использовать для оценки эффективности акклиматизации ремонтных свиноматок и хряков, введенных в стадо. Наличие антител является доказательством того, что акклиматизированные животные подвергались натуральному заражению микробом/микробами, находящимися на ферме, или были вакцинированы биопрепаратом, применяемым на ферме.

Если предположить, что представленные здесь данные и примеры относятся к PRRS, то представленные действия можно признать правильными для многих болезнетворных микроорганизмов, имеющих схожий характер.

В настоящее время в Польше для серологической диагностики PRRS чаще других используется система ELISA посредственная. (напр. PRRSV Antibody Test, Herd Check, IDEXX Laboratories) в котором исследует сыворотки инкубированных в бассейнах микропластинок, оказавшихся под воздействием антигена вируса. Если в сыворотке находятся типичные антитела, они связываются с микропластинкой, что обнаруживается в цветной реакции при использовании нужного конъюгата и субстрата.

Условные тиры антител (индекс) отвечающие области значения S/P

Индекс                Значение S/P

0              <0,4

1              0,4 — 0,99

2              1,0-1,49

3              1,5-1,99

4              2,0 -2,49

5              2,5 -2,99

6              = >3,0

Измерение интенсивности окрашивания (оптической густоты; optical density-OD) выполняется с использованием аппарата для чтения микрофильмов. Определение статуса исследуемой сыворотки происходит посредством сравнения значения ее OD с положительным значением стандартной сыворотки. Для этого делится значение OD исследуемой сыворотки (sample S) на значение OD стандартной положительной сыворотки (positive -Р). Полученное число, определяющее это соотношение (S/P), в полной мере может быть отнесено к титру типичных антител в сыворотке. Наибольшее значение S/P соответствует наивысшему титру антител. Значение S/P, которое ниже установленной опытной величины порога (напр. 0,4) считается отрицательным. Это не значит, что сыворотка, дающая в тесте ELISA значение S Р ниже 0,4, не содержит антител. Они могут быть, но их уровень находится ниже установленного порога чувствительности данного диагностического теста. Такое значение не исключает наличия вируса в крови, и даже его посева в среду. Это происходит чаще всего тогда, когда свинья была заражена устойчивым способом. Такая ситуация может повториться при живых вакцинах PRRS.

Фирма IDEXX разработала сравнительные таблицы значения титров антител и значения S Р(так назв. титр ELISA) и соотнесла целые числа областям значения S Р от 0 (сыворотка отрицательная) до 6 (сыворотка высоко положительная)(см. таблицу рядом). Это в определенной степени упростило интерпретацию серологических исследований.

Следует помнить, что в невосприимчивости к PRRS определяющую роль играет клеточная невосприимчивость. Поэтому ни наличие антител, ни их уровень, ни в коем случае не может быть связан с невосприимчивостью к инфекции. Единственно правильной интерпретацией положительного результата — подтверждение положительного результата — подтверждение контакта свиньи с вирусом, и что это произошло 7 дней до забора крови.

Исследуя соответственно большое количество сывороток от свиней разного возраста, можно приблизительно определить динамику развития заражения, в том числе и вероятный срок инфицирования конкретных возрастных групп животных. Можно также в определенной степени спрогнозировать и последствия заражения. Пути заражения, способ распространения инфекции в стаде, а также непостоянный ответ зараженных животных обуславливает тот факт, что реакция ELISA должна быть использована для определения серологического статуса стада или группы свиней, а не отдельных животных. Одним словом, количество присланных для исследования сывороток должно соответствовать численности группы животных, находящихся в одном здании, а лучше всего технологической группы. Кроме того, ELISA, как и другие серологические реакции, дают процент (до 5%) результатов ошибочно положительных. Присылать для исследования единичные сыворотки нецелесообразно. Результаты их анализа не позволяют сделать никаких выводов относительно статуса фермы, в которой производился забор крови.

Правила взятия образцов

Исследование отдельных образцов имеет смысл только при оценке купленных особей и находящихся на карантине. Следует исследовать пары сывороток, взятых у животных с промежутком в 3-4 недели; вполне правдоподобные результаты можно получить в том случае, если пробы сыворотки будут одновременно исследованы и на наличие антител (ELISA), и генетического материала для вируса PRRS (PCR). При оценке санитарного статуса фермы в отношении PRRS, а также и многих других заразных болезней нелишним будет проведение среза серологического исследования стада. Выработка правильной стратегии взятия образцов для получения объективных данных — задание непростое. С точки зрения теоретической и экономической необходимо разработать процедуру, которая обеспечит получение по возможности полного ответа на поставленные вопросы при более низкой стоимости исследования. Исследование проб непродуманным способом не позволит сделать какие-то выводы, несмотря на понесенные расходы.

Исследоеание образцов сыворотки на PRRS

Правила взятия проб и интерпретации серологических исследований

Можно предположить, что большее число проб, взятых от животных в разном возрасте, в общем, дает большие возможности установления собственного диагноза и предпринять результативные действия по исправлению ситуации. Следует отдавать себе отчет в том, что число образцов, которое следует брать для правильного исследования, зависит в большой степени от степени и динамики распространения фактора заражения в стаде. Ввиду расходов мы должны принять определенный порог доверия относительно точности полученных результатов. В серологическом исследовании PRRS вообще принимается количество проб, используемое в программах эрадикации болезни Ауески. Если хотим иметь 100% гарантию, что на ферме нет ни одной особи, имеющей антитела для PRRSV, конечно же, следует исследовать всех животных, и не один раз, лучше всего два раза, что в больших стадах вообще невозможно прежде всего из экономических соображений, поэтому порог доверия обычно принимается на уровне 95% или 99% (таб.14 и 15). При исследовании 30 свиней принятие порога доверия в 95% гарантируется 95% правдоподобия обнаружения одной серологически положительной особи, тогда как в популяции зараженных есть самое меньшее 10% свиней. В случае, когда зараженных составляет 50% свиней, из группы в 1000 животных достаточно исследовать 5 любых особей, чтобы с правдоподобием 95% обнаружить хотя бы одну серологически положительную. Если в таком стаде заражена одна свинья, надо исследовать 950 животных, чтобы иметь 95% уверенности, что ее обнаружили. Количество животных, реагирующих положительно в серологических реакциях, зависит от фазы заражения. На ее начальном этапе во время острого проявления признаков PRRS и в течение нескольких последующих недель, когда динамика распространения заражения высока, есть довольно высокий шанс правильно провести исследование, исследуя даже небольшое число сывороток. Зато на этапе хронической формы заражения, напр. спустя год или более от введения вируса, где большой процент животных иммунизировался после заражения, у многих свиней уровень антител низкий или необнаруживаемый, этот шанс меньший. Репрезентационное число образцов должно быть исследовано для каждой ситуации в отдельности. Американские авторы предлагают исследовать минимальное число сывороток:

-основное стадо: 30 образцов (по 6 образцов от свиноматок в разных фазах репродуктивного цикла; Свиноматки свободные; супоросные — в отдельных триместрах супоросности, кормящие свиноматки);

-поросята сразу же после отъема: 10 образцов;

- подсвинки перед их переводом на откорм: 10 образцов;

-откормочники перед убоем: 10 образцов;

-ремонтные свинки перед введением их в репродуктивное стадо: 10 образцов.

Исследование соответствующего числа сывороток, полученных от разных возрастных групп животных, позволяет установить так называемый серологический профиль стада и на этой основе произвести предварительную оценку его эпизоотической ситуации. Конечно, результаты лабораторных исследований должны быть связаны с результатами опроса и данными осмотра санитарного состояния всего стада.

Ниже представлены примеры, с которыми можно пользоваться каждый день.

Интерпретация результатов.

Пример 1

Подтверждение одного низкого положительного результата, скорее всего, свидетельствует о нетипичной реакции в тесте ELISA. Однако нельзя исключить, что имеет дело с началом PRRS в стаде.

В данном случае, следует обязательно повторить исследование сыворотки от положительной свиноматки и особей, находящихся в том же или соседнем загоне спустя 2-3 недели.

Пример 1: иммунологический профиль свободного от болезни стада с результатом ошибочно положительным

Рост числа положительных сывороток будет свидетельствовать о имеющем место заражении. Но если при повторном исследовании результаты будут отрицательными, или та же свиноматка даст положительный результат при низком значении индекса, это будет свидетельствовать о нетипичной реакции в тесте ELISA. Если клинические признаки напоминают PRRS, их причины следует искать в другом месте (следует исключить лептоспироз и болезнь Ауески).

Пример 2

Наличие низких значений титров во всех возрастных группах свиней, прежде всего у свиноматок, говорит о длительном заболевании стада. Такое состояние наблюдается

Пример 2: Иммунологический профиль, типичный для стада с хроническим заболеванием

около полугода от внедрения PRRSV при проведении правильной акклиматизации или вакцинации ремонтных свинок. На этом этапе обычно наблюдаются признаки болезни в дыхательной системе у поросят на 2-6 неделе их жизни. Скорее всего, некоторые свиноматки рождают устойчиво (во время супоросности) зараженных новорожденных, в то время как другие рождают свободных от вируса поросят.

После отсадки, инфекция поражает всю группу подсвинков, здоровые поросята, свободные от вируса и не имеющие антител, заражаются от устойчиво зараженных поросят или от старших подсвинков, с которыми имели контакт после отсадки (при несоблюдении принципа «пусто-занято»). В результате PRRS кружит по всем возрастным группам свиней. В таких случаях можно ожидать, что вирус будет обнаружен в крови и органах подсвинков.

Пример 3

Подтверждение значение титра 6 или/и 5 во всех возрастных группах животных является доказательством типичной серологической картины острой формы PRRS во всех технологических группах. У определенного процента свиноматок случаются выкидыши, преждевременные опоросы и рождение слабых поросят. Те поросята, которые переживут отсадку, страдают синдромом нарушения дыхания (PRDC’).

Пример 3: Иммунологический профиль стада недавно заболевшего (стадо нестабильно активное)

                Индекс сыворотки                                        

Сыворотка   Свиноматки   Поросята 4 нед.   Поросята 8 нед     Откормочники                                               

1              5              0              5              1

2              4              5              6              6

3              5              0              1              6

4              6              1              0              3

5              0              1              3              1

6              1              1              4              0

7              5              2              3              3

8              2              3              1              5

9              0              0              0              6

10           0              4              0              1

Обычно вирус обнаруживается в крови и органах свиней. Следует помнить, что, несмотря на интенсивность кружения инфекции в стаде, не в каждом случае появляются клинические признаки болезни.

                Индекс сыворотки                                        

Сыворотка         Свиноматки      Поросята 4 нед.               Поросята 8 нед.               Откормочники

                                                               

1              0              0              0              0

2              0              0              0              0

3              0              0              0              0

4              0              0              0              0

5              0              0              0              0

6              0              0              0              0

7              0              0              0              0

8              0              0              0              0

9              0              0              0              0

10           1              0              0              0

                Индекс сыворотки                                        

Сыворотка         Свиноматки      Поросята 4 нед.               Поросята 8 нед                Откормочники

                                                               

1              0              0              3              1

2              2              0              4              1

3              1              0              6              2

4              1              0              3              2

5              1              1              2              1

6              0              0              4              2

7              0              0              2              2

8              1              1              1              1

9              1              1              3              1

10           0              0              6              1

Правила взятия проб и интерпретации серологических исследований

Пример 4

Высокие и различные индексы у свиноматок основного стада показывают, что в группе животных началась инфекция PRRS.

Пример 4: Иммунологический профиль стада, зараженного недавно (стадо нестабильно активное)

Принимая во внимание значение индексов, можно выразить мнение, что заражение произошло самое меньшее за 6 недель до взятия проб. И что инфицирование произошло не ранее 10 недель, о чем свидетельствует отсутствие антител в группе 8-недельных отсаженных поросят и откормочников. Можно прийти к выводу, что в период исследования все санитарные проблемы (выкидыши, преждевременные роды) концентрировались в секторе родовом, что склонило врача выдвинуть подозрение на PRRS и принять решение о том, чтобы переслать сыворотку для исследования. Можно подозревать, что скоро появятся проблемы и в выращивании поросят.

В каждой ситуации следует отдавать себе отчет в том, что среди PRRS встречаем штаммы в большей или меньшей степени вирулентные. На сегодняшний день неизвестны методы определения вирулентности штаммов in vitro. Не всегда обнаружение даже острой фазы заражения стада свидетельствует о том, что проблемы состояния здоровья стада вытекают из этого заражения. Отсюда необходимость одновременных исследований напр. микоплазмоза, лептоспироза, болезни Ауески или послеотьемного мультисистемного синдрома похудения свиней.

Некоторые диагностические лаборатории представляют одни и те же результаты исследований в графической форме. Таким образом, примерно представлены эпизоотические ситуации недавно зараженного стада (см. пример 3)

Число сывороток 10

Свиноматки

Л Л/-ШШШ ~ ШуЖ7

6 Титры

Число сывороток 8-недельные поросята

10 9 8 7 Шш

6 Титры

Число сывороток 4-недепьные поросята

10/11_ Л г

Титры

Число сывороток

6-месячные откормочники

Титры

                Индекс сыворотки                                        

Сыворотка         Свиноматки      Поросята 4 нед.               Поросята 8 нед.               Откормочники

                                                               

1              5              0              0              0

2              4              0              0              0

3              5              0              0              0

4              6              1              0              0

5              0              1              0              0

6              1              1              0              0

7              5              2              0              0

8              2              3              0              0

9              0              0              0              0

10           0              4              0              0

Приведенные факты показывают, что связанный с серологическим исследованием процесс оценки эпизоотической ситуации в стаде является кропотливым и дорогим. Однако это не в коем случае не означает, что им надо пренебречь, т.е. борьбой с PRRS или с другими заразными болезнями. Этот принцип имеет особое значение в случае его использования в программах борьбы с прививками.

О проведении иммунопрофилактики, проведенной с их участием, определяет соответствующий момент использования биопрепарата, что является возможным только в опоре на точно проведенное, правильно организованное и интерпретированное лабораторное исследование.

Литература 

1.Cho,   Н. J., Deregt, D., Joo, Н. S.: An ELISA for porcine reproductive and respiratory syndrome: production of antigen of high quality. Can. J. Vet. Res. 1996, 60, 89-93.

2.Houben            S., Callebaut R, Pensaert M.B.: Comparative study of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay and the immunoperoxidase monolayer assay for the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs. J. Virol. Meth. 1995, 51, 125-128. 3.Sorensen K.J., Botner A., Madsen E.S., Stran-dbygaard В., Nielsen J.: Evaluation of a blocking Elisa for screening of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus. Vet. Microbiol. 1997, 56, 1-8.

4.Stadejek Т.: Metody laboratyjnego rozpoznawania zespolu rozrodczo-oddechowego swin (PRRS) i interpretacja wynikow, „Magazyn Wet." Suplement. Swinie.

Комментарии закрыты.